按照反应体系添加试剂
更新日期:2021-10-15     浏览次数:9
核心提示:2.3 RPA反应体系的建立根据RPA检测试剂盒说明书进行加样,60 L体系如下:(1)①管:2.5 L 10 mol/L的上、下游引物,混合均匀;②管:29 L 2 Reaction

2.3  RPA反应体系的建立

根据RPA检测试剂盒说明书进行加样,60 μL体系如下:

(1)①管:2.5 μL 10 μmol/L的上、下游引物,混合均匀;②管:29 μL 2× Reaction Buffer、9.6 μL 1.8 mmol/L dNTPs、6 μL 10× Basic E-Mix,充分混匀,向管盖加3 μL 20× Core Reaction,充分混匀[12]

(2)将②管的混合液取出,放入①管中,摇晃①管使其融合,再加入280 mM的Mg2+ 6.4 μL和60 ng/μL的核酸1 μL,轻轻拨弹①管使其融合[13]

(3)确定反应的最优反应时间:以60 ng/μL浓度的转Bt玉米基因组为模板,取最优引物,按上述体系添加试剂,反应温度为37 ℃,设置扩增时间分别为20 min、25 min、30 min、35 min、40 min。反应结束后取出产物,进行纯化处理,做2 % AGE,观察AGE结果,确定最优反应时间[14]